Effetti non genomici degli steroidi

Highly potent siRNAs are assessed using bioinformatic approaches so that they target a unique site in a specific gene. However, as with many biological reactions, siRNA-induced silencing will generate specific and non-specific effects. In the case of siRNA, these non-specific effects can be general responses to the presence of dsRNA molecules and to transfection and experimental manipulation of the cells. Off-target effects are related to the siRNA itself and most often arise from partial complementarily of the sense or antisense strands to an unintended target. These effects are concentration dependent and therefore the best way to minimize these off-target effects is by reducing siRNA concentrations. The SMARTpool strategy takes advantage of this by ensuring lower concentrations of each individual siRNA while maintaining a higher total concentration of siRNA against the target of interest. We also suggest employing a chemical modification such as ON-TARGETplus to reduce off-target effects from both strands. Finally, bioinformatic approaches may be used to select sequences that are less likely to exhibit a high degree of off-targeting. All three strategies (pooling, modification, and bioinformatics) are combined in our pre-designed ON-TARGETplus siRNA products.

11 Introduzione GLI ELEMENTI RESPONSIVI AGLI ESTROGENI I recettori degli estrogeni, come tutti i recettori nucleari, regolano la trascrizione interagendo con specifiche sequenze di DNA localizzate a livello dei geni bersaglio, denominate elementi responsivi agli estrogeni (ERE, estrogen responsive elements). Generalmente si trovano in stretta vicinanza del promotore, tuttavia le si può ritrovare anche all interno di regioni enhancer, diverse chilobasi a monte del sito d inizio di trascrizione MECCANISMO D AZIONE DEI RECETTORI DEGLI ESTROGENI A) Via classica ligando-dipendente In assenza del ligando, il recettore degli estrogeni è sequestrato nel nucleo delle cellule bersaglio ed è complessato con proteine dello shock termico (heat shock proteins, Hsp) che lo mantengono nella conformazione inattiva. In seguito al legame con l estrogeno, il recettore va incontro ad un cambiamento conformazionale che determina il distacco delle Hsp e facilita la dimerizzazione ed il legame del recettore agli elementi responsivi sul DNA situati sui geni bersaglio [Mc Donnel et al, 2002]. Le regioni del recettore coinvolte nella dimerizzazione sono localizzate su domini che contengono una regione ricca di amminoacidi idrofilici, in modo tale da organizzare spazialmente un α-elica. Da questa struttura secondaria sporgono numerosi residui di leucina allineati che possono andare ad interagire con un analoga struttura su un altro monomero recettoriale formando una sorta di cerniera di residui di leucina, detta leucinzipper che consente la dimerizzazione. L ER può legarsi al DNA sia sottoforma di omodimero sia di eterodimero. Il recettore utilizza entrambe le sue regioni di attivazioni AF-1 ed AF-2 per reclutare i cofattori. Il legame del complesso ormone-recettore al DNA stabilizza il complesso d inizio della trascrizione e favorisce il reclutamento dell RNA polimerasi II per dare l avvio alla trascrizione del mrna specifico. L attività trascrizionale del recettore degli estrogeni può essere modulata attraverso un meccanismo di fosforilazione. Si è infatti osservato che l ER è altamente fosforilato già in condizioni basali e che il legame dell ormone comporta un incremento del grado di fosforilazione. L introduzione dei gruppi fosforici è mediata da diversi enzimi dotati di attività protein chinasica: fra questi, i più importanti sono le MAPK che fosforilano i residui di serina posti all interno di sequenze amminoacidiche consenso. La fosforilazione del recettore 9

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